:: Публикации :: Научные статьи :: Вирусный гепатит :: Значение оценки ранней активации субпопуляций лимфоцитов и внутриклеточной продукции ими интерферона γ в клинической диагностике острых вирусных гепатитов А и В

Значение оценки ранней активации субпопуляций лимфоцитов и внутриклеточной продукции ими интерферона γ в клинической диагностике острых вирусных гепатитов А и В

Версия для скачивания (article37.doc, 167.5Кб)

Новосибирский государственный медицинский университет, НИИ клинической иммунологии СО РАМН,НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН, г. Новосибирск

Введение
Важной задачей клинической диагностики при острых вирусных гепатитах (ВГ) является выделение в ранние сроки болезни пациентов с риском ее тяжелых, неблагоприятных форм для дифференцированных подходов к терапии. Индивидуальный характер течения заболевания находит отражение не только в его клинических чертах, но и в определенном спектре иммунологических реакций. Несмотря на большое число иммунологических исследований при острых ВГ, проблема поиска показателей, информативных в системе диагностики и прогнозирования при этих заболеваниях, остается актуальной [1,2]. Перспективным в этом плане представляется изучение функциональной активности иммунокомпетентных клеток, эффекторов и регуляторов противовирусного ответа. На современном уровне оно предусматривает оценку экспрессии ряда маркеров активации лимфоцитов, а также способности лимфоцитов к продукции определенных цитокинов, что свидетельствует о преимущественной направленности иммунного ответа [6, 11]. В единичных исследованиях при острых вирусных гепатитах А и В [3, 4] изучена экспрессия позднего маркера активации CD25 всей популяцией лимфоцитов без учета степени тяжести заболевания. Для диагностики тяжелого течения в ранние сроки болезни представляется важной и оценка экспрессии ранних маркеров активации лимфоцитов, таких как CD69.

Об интенсивности иммунного ответа преимущественно по Th1 типу можно судить по внутриклеточной продукции лимфоцитами так называемых «цитокинов 1 типа», в частности интерферона γ (IFNγ) [16]. В исследовании Matsumura S. et al. (2001) при остром ВГВ этот принцип был использован для характеристики функциональной активности цитотоксических CD8+-лимфоцитов. С целью более глубокого понимания взаимосвязи клеточных иммунных механизмов с определенными вариантами течения острых вирусных гепатитов А и В нами проведена оценка функциональной активности отдельных субпопуляций лимфоцитов (CD4+, CD8+, CD16+), по экспрессии ими маркера ранней активации CD69 и внутриклеточной продукции IFNγ при различной степени тяжести заболевания.

Материалы и методы:
Иммунологические исследования были проведены у 50 человек: 38 больных острыми вирусными гепатитами А и В (20 мужчин и 18 женщин в возрасте от 18 до 49 лет, средний возраст 29,6+1,6 лет), госпитализированных в Муниципальную инфекционную клиническую больницу № 1 г. Новосибирска в 2004 г., и 12 клинически здоровых лиц, у которых не были выявлены маркеры ВГ, составивших группу контроля (5 мужчин и 7 женщин в возрасте от 22 до 56 лет, средний возраст 27,5+3,4 лет). Диагноз острого ВГ устанавливали на основании эпидемиологических и клинических данных, результатов биохимического исследования. Этиологию ВГ верифицировали определением маркеров ВГА, ВГВ и ВГС методом ИФА. В определении степени тяжести заболевания ведущими критериями являлись выраженность интоксикационного синдрома и наличие признаков печеночно-клеточной недостаточности.

В числе исследованных пациентов было 15 больных острым ВГА (6 чел. - с тяжелой формой болезни, 9 чел.- со среднетяжелой) и 23 больных острым ВГВ (17 чел. - с тяжелой формой, 6 чел. - со среднетяжелой). Острый ВГВ у 4 человек развился на фоне хронического гепатита С, у 2 человек имела место внутривенная наркомания, у 2 человек - хронический алкоголизм.

Иммунологические исследования у больных острыми ВГ осуществляли на первой неделе желтушного периода (периода разгара болезни). Проводили иммунофенотипирование клеток периферической крови: определяли содержание лимфоцитов, несущих поверхностные рецепторы CD3, CD4, CD8, CD16, CD20, иммунорегуляторный индекс, содержание DR-позитивных моноцитов. Также определяли содержание фагоцитирующих гранулоцитов и моноцитов. Процентное содержание СD8+, СD4+ и СD16+-лимфоцитов, экспрессирующих CD69 молекулы, оценивали методом проточной цитофлуориметрии. Для этого из периферической крови получали лейковзвесь. После отмывки к ресуспендированному осадку добавляли моноклональные анти-CD4-FITC, анти-CD8-FITC, анти-CD16- FITC и анти-CD69-PE антитела (Becton Dickinson, США) в объёме, указанном фирмой-производителем, и инкубировали в темноте в течение 15 минут при 20°С. После этого клетки отмывали и фиксировали. Готовые пробы хранили при 4°С до проведения цитометрического исследования.

Оценку внутриклеточной продукции IFNγ CD3+, СD4+ и CD8+-лимфоцитами проводили методом проточной цитофлуориметрии. Методика основана на прямой детекции продукции IFNγ внутри клетки с помощью антител к IFNγ, конъюгированных с флюорохромом, после короткого периода (4-6 часов) активации различными стимуляторами. В данной работе определение IFNγ в цитоплазме периферических CD3+, CD4+ и CD8+-лимфоцитов проводили по методике Maino V.C., Picker L.J. [16].

Мононуклеарные клетки периферической крови ресуспендировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% FCS, 5мМ L-глутамин, 10мМ Hepes и переносили в лунки 24-луночного культурального планшета (Falcon, США) в концентрации 106 клеток на лунку и культивировали в течение 4 часов в присутствии стимулятора РМА (30 нгр/мл), кальциевого ионофора иономицина (1 мкгр/мл) и ингибитора белковой секреции брефелдина А (10мкгр/мл) при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2. После окончания культивационного периода клетки собирали в цитометрические пробирки (Falcon, Becton Dickinson, США), осаждали центрифугированием (5-7 минут, 1000 об/мин). К осадку добавляли моноклональные анти-CD8-PerCP и анти-CD3-FITC антитела в объёме, указанном фирмой-производителем, и инкубировали в темноте в течение 15 минут при 20°С. Клетки фиксировали 1% параформальдегидом, после чего пермеабилизировали 0,02% Твином-20 и добавляли моноклональные анти-IFN-g-РЕ. По окончании инкубации с антителами и двукратной отмывки клетки фиксировали 0,5% формальдегидом.

Относительное количество IFNγ-содержащих клеток определяли методом трехцветной проточной цитометрии. Образцы анализировали на проточном цитометре FACS Calibur (Becton Dickinson, США) с использованием программы СellQuest Pro (Becton Dickinson, США). По параметрам прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеивания определяли лимфоцитарную область, из которой выделяли субпопуляции CD3+ Т-клеток, используя график SSC против FL-1. Процент IFNγ - содержащих CD4+ или CD8+ клеток определяли с помощью графика FL-2 против FL-3.

Статистическая обработка данных проводилась с определением достоверности различий по критерию Манна–Уитни и коэффициента корреляции Спирмена с применением прикладной программы STATISTICA-5,5.

Результаты и обсуждение
С учетом различной биологии вирусов гепатита А и В, предполагающей особые взаимоотношения возбудителя и организма хозяина, анализ иммунологических показателей был проведен отдельно в группах больных ВГА и ВГВ.

У больных ВГА (таблица 1) субпопуляционная структура лимфоцитов характеризовалась увеличением относительного числа CD8+-лимфоцитов, снижением содержания CD4+-лимфоцитов, иммунорегуляторного индекса, числа фагоцитирующих гранулоцитов и моноцитов по сравнению с контролем. При исследовании функциональной активности отдельных субпопуляций лимфоцитов была установлена тенденция к увеличению по сравнению с контролем содержания CD4+-лимфоцитов, экспрессирующих CD69, и CD4+-лимфоцитов, содержащих IFNγ. Также была выявлена тенденция к повышению по сравнению с контролем содержания CD8+IFNγ+-клеток и установлена сильная положительная корреляция (r=0,7, р<0,05) между содержанием CD8+69+-клеток и содержанием CD8+IFNγ+-клеток, что предполагает взаимосвязь ранней активации цитотоксических лимфоцитов CD8+ и способности их к продукции IFNγ. Сильная положительная корреляция также установлена между содержанием CD8+IFNγ+-лимфоцитов и фагоцитирующих моноцитов (r=0,95, р<0,05), а также фагоцитирующих гранулоцитов (r=0,7, р<0,05), что может отражать стимулирующее влияние IFNγ в отношении функциональной активности макрофагов. Функциональная активность цитотоксических лимфоцитов CD8+ и Т-лимфоцитов-хелперов CD4+ в ранний период острых вирусных инфекций сопряжена, как известно, с активацией натуральных киллеров, что подтверждается выявленной тенденцией к повышению числа CD16+69+-лимфоцитов.

Синдром интоксикации при ВГА, являющийся основным критерием тяжести заболевания, отражает характер и интенсивность каскада цитокиновых реакций, которые, являясь компонентом необходимой защиты, одновременно играют и повреждающую роль. Установленная положительная корреляция (r=0,5, р<0,05) между содержанием CD4+СD69+-клеток и продолжительностью интоксикационного синдрома у больных ВГА объяснима возможной повышенной продукцией провоспалительных цитокинов, которая во многом инициируется и осуществляется активированными Т-хелперами 1.

Полученные нами данные свидетельствуют в пользу развития при ВГА иммунных реакций преимущественно по клеточному типу с ведущей ролью Т-хелперов 1. Адекватный клеточный иммунный ответ обеспечивает острое циклическое течение ВГА, характеризующееся ярким, но кратковременным синдромом интоксикации, выраженным в период разгара синдромом цитолиза и санацией организма от вируса. Аналогичные заключения о закономерностях иммунного ответа при ВГА сделаны авторами исследований последних лет [4,8] на основании результатов изучения субпопуляционной структуры лимфоцитов, экспрессии ими ряда маркеров активации (CD25, CD95) и изменению уровней сывороточных цитокинов.

ВГА всегда рассматривали как неопасную саморазрешающуюся инфекцию, чаще протекающую субклинически или в легкой форме. Однако в последнее десятилетие в условиях диссимбиоза как глобального биологического явления, обусловившего прогрессирование дестабилизационных процессов в организме человека в масштабах популяции, наблюдается изменение структуры форм болезни - увеличение доли нетипичных и тяжелых форм болезни и даже возникновение фулминантных случаев ВГА [12, 14].

С целью прояснения механизмов формирования вариантов течения ВГА, поиска показателей, информативных для ранней диагностики его тяжелых форм, нами проведено составление иммунологических параметров с различной степенью тяжести заболевания (таблица 1). Отличием субпопуляционной структуры лимфоцитов у больных тяжелым ВГА было увеличение доли CD8+-лимфоцитов и снижение содержания CD4+-лимфоцитов по сравнению с контролем (р<0,05), чего не отмечалось при средней степени тяжести заболевания. В обеих подгруппах отмечалось достоверное по сравнению с контрольной группой снижение иммунорегуляторного индекса, числа фагоцитирующих гранулоцитов и моноцитов.

При тяжелых и среднетяжелых формах ВГА наблюдались однонаправленные изменения ряда показателей функциональной активности клеток-эффекторов противовирусного ответа, отражающие формирование иммунных реакций преимущественно по клеточному типу: тенденция к повышению по сравнению с контролем числа CD4+69+-лимфоцитов и CD8+-лимфоцитов, содержащих IFNγ. Однако выявлены и отличия показателей функциональной активности субпопуляций Т-лимфоцитов при различной тяжести болезни. Они представлены при тяжелом ВГА достоверным увеличением содержания CD3+IFNγ+-клеток и CD8+CD69+-клеток по сравнению как с контролем, так и со среднетяжелой формой болезни, а также тенденцией к повышению содержания CD4+IFNγ+-клеток и CD16+CD69+-клеток по сравнению с контролем, которой не выявлено при средней тяжести ВГА.

В интерпретации полученных данных мы исходили из положения о двоякой роли клеточных иммунных реакций при ВГ: при всей их целесообразности в обеспечении благоприятного течения инфекционного процесса и ранней санации организма, они являются и главным индуктором повреждения инфицированных клеток [11]. В соответствии с общими закономерностями иммунопатогенеза вирусных инфекций, возбудители которых лишены прямого цитопатического действия, концепция иммуноопосредованного повреждения ткани печени, которой давно придерживаются при ВГВ, нашла признание и при ВГА [8]. Учитывая, что цитотоксичность CD8+-лимфоцитов считается важным механизмом специфической противовирусной защиты и одновременно существенным фактором повреждения гепатоцитов, можно с учетом полученных нами результатов допустить роль выраженной ранней активации CD8+-лимфоцитов в развитии тяжелых форм ВГА. В пользу этого свидетельствует и установленная нами положительная корреляционная связь (r=0,62, р<0,05) между содержанием CD8+69+-лимфоцтов и показателем цитолитического синдрома (уровнем аланинаминотрансферазы в сыворотке крови), отражающим степень повреждения гепатоцитов.

В оценке повышенной способности лимфоцитов к продукции IFNγ при тяжелых формах ВГА необходимо исходить из биологии этой инфекции, при которой пик санирующих реакций приходится уже на период разгара болезни. Можно предположить, что в эти сроки заболевания повышенная способность Т-лимфоцитов (в частности, Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов) к продукции IFNγ имеет значение для реализации не только его противовирусного эффекта, но и регулирующей роли этого цитокина в активации клеток-эффекторов иммунной системы, т.е. усиления клеточной цитотоксичности и фагоцитоза. Эта мысль подтверждается выявленной у исследованных больных ВГ сильной положительной корреляцией между содержанием CD8+IFNγ+ и CD8+СD69+-клеток (r=0,7, p<0,05), а также содержанием CD8+IFNγ+-лимфоцитов и фагоцитирующих моноцитов (r=0,5, p<0,05) и гранулоцитов (r=0,7, p<0,05). Таким образом, можно полагать, что развитие тяжелых форм ВГА сопряжено не только с ранней активацией цитотоксических Т-лимфоцитов, но и с их повышенной способностью к продукции IFNγ. При изучении механизмов клеточного иммунитета при ВГВ, которому в последнее десятилетие уделялось много внимания [3, 5, 7, 10, 13, 15, 17, 18], получены неоднозначные данные. Значение активности клеток-регуляторов и эффекторов противовирусного ответа в формировании различной степени тяжести болезни требует уточнения.

У исследованных нами больных ВГВ выявлены (таблица 2) однонаправленные изменения субпопуляционной структуры лимфоцитов при тяжелой и среднетяжелой форме болезни: достоверное повышение относительного числа СD8+-лимфоцитов по сравнению с контролем, снижение относительного содержания CD4+-лимфоцитов, иммунорегуляторного индекса, содержания CD16+-лимфоцитов, числа фагоцитирующих гранулоцитов и моноцитов. Тогда как при изучении функциональной активности лимфоцитов в данных подгруппах больных установлены определенные отличия (таблица 2). Так, при среднетяжелом ВГВ имела место тенденция к повышению доли CD4+CD69+-лимфоцитов в сочетании с достоверным повышением содержания CD4+IFNγ+-клеток и тенденцией к повышению содержания лимфоцитов CD3+ IFNγ+ и СD8+IFNγ+. При тяжелом ВГВ тенденция к увеличению числа активированных CD4+CD69+-клеток не сопровождалась повышением содержания субпопуляций лимфоцитов, содержащих IFNγ. Выявленные при среднетяжелом ВГВ особенности иммунологических реакций, возможно, являются отражением благоприятного варианта течения болезни, который нередко завершается освобождением от вируса при этой потенциально персистирующей инфекции. Это согласуется с литературными данными о том, что высокие показатели содержания сывороточного IFNγ, а также его продукции лимфоцитами у больных ВГВ ассоциированы с благоприятным исходом заболевания [9].

Установленные нами закономерности при тяжелом ВГВ, в свою очередь, могут отражать неадекватность иммунологических реакций, которая предопределена не только генетически, но и исходным неблагополучием организма, сложившимися изменениями в его эндобиоценозе.

Наличие предшествующей острому ВГ сочетанной соматической патологии, свидетельствующей о существенных изменениях в гомеостазе, во многом предопределяет характер иммунологических реакций в ответ на внедрение в организм конкретного вируса. В этой связи мы проанализировали иммунологические показатели в подгруппе больных ВГВ с измененным преморбидным фоном, в частности, с хроническим гепатитом С, внутривенной наркоманией или алкоголизмом (таблица 2). Данная подгруппа включала пациентов как тяжелыми, так и среднетяжелыми формами болезни и характеризовалась достоверным по сравнению с контролем повышением содержания CD8+-лимфоцитов, снижением содержания CD4+-лимфоцитов, иммунорегуляторного индекса, а также тенденцией к повышению по сравнению с контролем доли CD4+, CD8+, CD16+-лимфоцитов, экспрессирующих маркер ранней активации CD69, и содержания CD8+IFNγ+-лимфоцитов, чего не отмечалось в оппозитной группе. Выявленные особенности иммунного реагирования у больных ВГВ с измененным преморбидным фоном мы оцениваем с позиций наличия у них исходных нарушений соматической регуляции, состояния дисбиоза, эндогенной интоксикации, что означает напряжение ключевых систем организма, снижение их надежности, обусловливает повышенное расходование резерва защиты, при котором трудно рассчитывать на сдерживание новых инфекционных агентов биологическими ресурсами организма.

Таким образом, рассмотрение показателей функциональной активности субпопуляций иммунокомпетентных клеток в общем контексте клинических и лабораторных данных дает дополнительные аргументы для уточнения клинического диагноза, осуществления дифференцированного подхода в обосновании регулирующей терапии при внешне сходной симптоматике острого ВГ и формирования индивидуальной системы оценки ее эффективности.

Примечания: * - достоверность различий по отношению к контролю (p<0,05),
**- достоверность различий между сравниваемыми подгруппами больных (p<0,05),
*** - процентное содержание клеток от общего числа лимфоцитов,
Me(Q1-Q3) - медиана (нижний квартиль - верхний квартиль).

Литература:

1. Алешкин В.А. //Клиническая лабораторная диагностика. - 2002. - № 8. - С. 48-50.
2. Бондаренко А.Л. // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 1998. - № 3. - С .42-46.
3. Бударина Н.А. //Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2004. - № 3. - С. 42-45.
4. Бударина Н.А., Белая О.Ф., Чуланов В.П. //Тер. архив. - 2003. - № 11.- С. 31-35.
5. Жаров С.Н., Шахмарданов М.З., Лучшев В.И. // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2002. - № 3. – С.33-35.
6. Кашкин К.П. // Клиническая лабораторная диагностика. – 2004. - № 3. – С. 23-34.
7. Ковеленов А.Ю., Лобзин Ю.В., Михальцов А.К., Малков А.Н. // Тер. архив. – 2003. - № 11. – С 17-23.
8. Пак С.Г., Волчкова Е.В., Умбертова К.Т. // Тер. архив. – 1999. - № 11. – С. 8-10.
9. Приймяги Л.С., Кремерман И.Б., Тефанова В.Т. и др. // Вопросы вирусологии. – 1999. - № 2. – С.85-88.
10. Родина Д.В. // Мед. иммунология. – 2002. - № 2. – С.253-254.
11. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В. // Иммунология. - 2000. – № 1. – С.61-64.
12. Сiocca M. // Vaccine. – 2000. - № 18, Suppl. 1 – P. 71-74.
13. Chisari F.V., Ferrari C. // Annu. Rev. Immunol. – 1995. – Vol.13. – Р.29-60.
14. Durst R.Y. et al. // J. Clin. Gastroenterology. – 2001. –Vol. 32 (5). – P. 453-454.
15. Guidotti L.G. // Vaccine. – 2002. – Vol. 19, 20, Suppl. 4 – Р. 80- 82.
16. Maino V.C., Picker L.J. //Cytometry.- 1998. -Vol.34.- N 5. -P. 207-215.
17. Matsumura S., Yamatoto K., Shimada N. et al. // Clin. Exp. Immunol. – 2001. – Vol.124 (3). – Р. 435-434.
18. Urbani S., Boni C., Missale G. et al. // J. Virol. – 2002. – Vol.76 (24). – Р. 12423-12434.